Histidin liefert lange

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 15356 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Die Bildung von Glia-Narben behindert die Neurogenese und die Wiederherstellung der Nervenfunktion nach einer zerebralen Ischämie. Histamin zeigte im Frühstadium nach zerebraler Ischämie eine neuroprotektive Wirkung, seine Langzeitwirkung, insbesondere auf die Glia-Narbenbildung, wurde jedoch nicht charakterisiert. Bei verschiedenen Verabreichungsschemata für Histidin, eine Vorstufe von Histamin, stellten wir fest, dass die Behandlung mit Histidin in einer hohen Dosis im Frühstadium und in einer niedrigen Dosis im Spätstadium den bemerkenswertesten langfristigen Neuroprotektionseffekt mit verringertem Infarktvolumen und verbesserter neurologischer Funktion zeigte. Bemerkenswert ist, dass dieses Behandlungsschema auch den Glia-Narbenbereich deutlich reduzierte und die Migration der Astrozyten in Richtung des Infarktkerns erleichterte. Im Wundheilungstest und im Transwell-Test förderte Histamin die Astrozytenmigration signifikant. H2-Rezeptorantagonisten kehrten die Förderung der Astrozytenmigration und den durch Histidin bereitgestellten Neuroprotektion um. Darüber hinaus regulierte Histamin die GTP-gebundene kleine GTPase Rac1 hoch, während ein Rac1-Inhibitor, NSC23766, die Neuroprotektion von Histidin und seine Förderung der Astrozytenmigration aufhob. Unsere Daten zeigten, dass eine dosis-/stadienabhängige Histidinbehandlung, vermittelt durch den H2-Rezeptor, die Migration von Astrozyten in Richtung des Infarktkerns förderte, was der langfristigen neurologischen Erholung nach zerebraler Ischämie zugute kam. Daher kann die gezielte Behandlung des histaminergen Systems aufgrund seiner Wirkung auf Astrozyten eine wirksame Therapiestrategie für langfristige Verletzungen durch zerebrale Ischämie sein.

Zerebrale Ischämie ist die häufigste Todes- und Invaliditätsursache bei Erwachsenen. Derzeit ist die einzige zugelassene Behandlung für zerebrale Ischämie der rekombinante Gewebeplasminogenaktivator, der dem ischämischen Bereich eine Reperfusion verleiht, wenn er innerhalb von 4,5 Stunden nach der Ischämie verabreicht wird. Für langfristige Hirnverletzungen nach Ischämie steht noch kein wirksames neuroprotektives Therapeutikum zur Verfügung. Die komplexen pathophysiologischen Ereignisse nach einer zerebralen Ischämie entwickeln sich sowohl zeitlich als auch räumlich1 und behindern die Entwicklung eines lebensfähigen neuroprotektiven Wirkstoffs2. Beispielsweise sind NMDA-Antagonisten wirksam, um die neuronale Exzitotoxizität im frühen Stadium nach einer Ischämie zu lindern, während sie die langfristige neurologische Erholung möglicherweise nicht begünstigen, da NMDA-Rezeptoren für die Neuroplastizität von entscheidender Bedeutung sind3,4.

Astrozyten sind entscheidend an neuronalen pathophysiologischen Fortschritten nach zerebraler Ischämie beteiligt: Bereits 6 Stunden nach Beginn der zerebralen Ischämie werden Astrozyten aktiviert, um das Überleben von Neuronen zu erleichtern, möglicherweise durch antioxidative Abwehr, Stoffwechselunterstützung und Sekretion neuroprotektiver Substanzen; Diese reaktiven Astrozyten bilden auch eine Barriere, um die Ausbreitung der Läsion und die lokale Immunantwort einzudämmen5,6. Daher ist eine Verbesserung des Überlebens von Astrozyten ein entscheidendes Mittel zum Schutz des Gehirns vor zerebraler Ischämie7. Allerdings kann die Glia-Narbe, eine Barriere, die größtenteils aus Astrozyten besteht, die Neurogenese im Spätstadium ischämischer neuronaler Verletzungen behindern. Tatsächlich kann die Unterdrückung der Glia-Narbe die Neurogenese und die neurologische Genesung fördern8. Es besteht die Möglichkeit, dass eine dosis- und stadienabhängige Behandlungsstrategie eine sinnvolle Therapie für ischämische Hirnverletzungen sein könnte, indem diese zeitabhängigen Wirkungen von Astrozyten koordiniert werden.

In unserer vorherigen Studie wurde festgestellt, dass Histamin Astrozyten erheblich vor Verletzungen schützt, die durch Sauerstoff-Glukose-Mangel verursacht werden9. Die durch den astrozytären H1-Rezeptor vermittelte Hochregulierung der Glutaminsynthetase- und Glutamattransporter-1-Expression trägt zur schützenden Wirkung von Histamin durch die Beseitigung des überschüssigen extrazellulären Glutamats bei, was dazu beiträgt, die Exzitotoxizität im Frühstadium der zerebralen Ischämie zu lindern9,10. Darüber hinaus gibt es zahlreiche Belege dafür, dass Histamin im Frühstadium nach einer zerebralen Ischämie einen Neuroprotektionseffekt bietet11,12. Die intraperitoneale Verabreichung von Histidin, einem Vorläufer von Histamin, unmittelbar und 6 Stunden nach der Reperfusion lindert den durch einen vorübergehenden Verschluss der mittleren Hirnarterie (tMCAO) verursachten Infarkt erheblich11. Es wird angenommen, dass Histamin eine direkte neuroprotektive Wirkung hat, indem es die NMDA-induzierte Exzitotoxizität über H2-Rezeptoren und den cAMP/PKA-Signalweg lindert13. Außerdem unterdrückt die Verstärkung der zentralen histaminergen Aktivität die Rekrutierung entzündlicher Zellen nach zerebraler Ischämie14. Insgesamt scheint das histaminerge System ein potenzielles therapeutisches Ziel für durch zerebrale Ischämie verursachte Hirnverletzungen zu sein.

Die Langzeitwirkung von Histamin nach zerebraler Ischämie wurde jedoch nicht untersucht, insbesondere seine Wirkung auf Astrozyten im späten Stadium der Glia-Narbenbildung. Da Histamin die Blut-Hirn-Schranke nicht direkt durchdringen kann, wurde Histidin verwendet, um die langfristigen Auswirkungen von Histamin auf Verhaltens- und histologische Reaktionen auf zerebrale Ischämie sowie die möglichen Mechanismen unter verschiedenen stadienabhängigen Verabreichungsschemata zu testen.

Die pathophysiologischen Ereignisse nach einer zerebralen Ischämie sind kompliziert, d. h. die akute Exzitotoxizität und die entzündliche Infiltration treten normalerweise innerhalb einer Woche nach Beginn der Ischämie auf, während die Bildung von Glia-Narben und die Neurogenese häufig erst danach auftreten1. Daher experimentierten wir zunächst mit den Histidin-Dosen (200, 500 oder 1000 mg/kg) während der ersten Woche, bei denen es sich häufig um ausgewählte Dosierungen bei der Untersuchung zerebraler Ischämie handelt11,15,16. Wir fanden heraus, dass die höchste Dosis den stärksten Schutz bot, was durch den neurologischen Defizit-Score (Abb. 1A; n = 13–15) und die Messung der Infarktfläche mittels MRT (Ergänzung Abb. 1; n = 5–6) belegt wurde. Daher wurde als Dosierung für die erste Woche 1000 mg/kg gewählt und in den späteren Wochen wurden andere Dosierungen verabreicht. Unter verschiedenen Behandlungsschemata (angezeigt als Kombination aus früher Dosierung und später Dosierung) haben wir die langfristigen Auswirkungen von Histidin auf die neurologische Leistungsfähigkeit und die kognitiven Fähigkeiten mithilfe des Morris-Wasserlabyrinths und des Angstkonditionierungstests für gedächtnisbezogene Gehirnregionen wie Striatum, Neokortex und Amygdala sind nach tMCAO häufig beeinträchtigt17,18,19,20. Wir fanden heraus, dass die Histidinbehandlung (1000–500 mg/kg) die bemerkenswerteste Schutzwirkung auf die neurologische Leistung zeigte (Abb. 1B; n = 13–15 für Tag 14 und Tag 28; n = 7–9 für Tag 42 und). Tag 56). Im Morris-Wasserlabyrinth-Test, der 22 Tage oder 50 Tage nach der Ischämie durchgeführt wurde, reduzierten alle Histidinbehandlungen die Fluchtlatenz im räumlichen Lernprozess signifikant (analysiert durch ein allgemeines lineares Modell, P < 0,05; Abb. 1D: n = 13–15; Abb . 1F: n = 7–9). Beim Probe-Test gibt es jedoch keinen Unterschied zwischen ihnen, was sich auf die Speichererhaltung bezieht. Im Angstkonditionierungstest zeigte die Histidin (His) 1000–500-Gruppe am 27. und 55. Tag das beste Kontextgedächtnis und Cued-Gedächtnis im Vergleich zu anderen Behandlungskombinationen (Abb. 1E: n = 13–15; Abb. 1G: n =). 7–9).

Histidin bietet Neuroprotektion für die neurologische Funktion und die kognitiven Fähigkeiten nach fokaler zerebraler Ischämie.

Neurologische Scores wurden am 1., 3. und 7. Tag nach der Ischämie unter der Behandlung mit Histamin (A, 200, 500 oder 1000 mg/kg) und am 14., 28., 42. und 56. Tag nach der Ischämie unter der Behandlung ausgewertet Behandlung der Histidin-Behandlung (B, 1000 mg/kg für die erste Woche, aber 0, 200, 500 oder 1000 mg/kg für spätere Wochen, benannt als His 1000–0, His 1000–200, His 1000–500 oder His 1000 –1000). Die kognitiven Fähigkeiten wurden nach der Ischämie durch das Morris-Wasserlabyrinth (D: Tag 22–24; F: Tag 50–52) und einen kontextuellen und impulsbezogenen Angstkonditionierungstest (E: Tag 27, G: Tag 55) untersucht. Die repräsentativen Schwimmwege am 24. Tag in (D) wurden in (C) gezeigt und der graue Kreis zeigt die Position der Plattform an. n = 13–15 für A, B (Tag 14 und Tag 28), D und E; n = 7–9 für B (Tag 42 und Tag 56), F und G. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, verglichen mit der Scheingruppe an jedem Testtag oder jedem Test, # P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, verglichen mit der tMCAO-Gruppe an jedem Testtag oder jedem Test.

Anschließend führten wir die histologische Untersuchung nach verschiedenen Histidin-Behandlungsschemata durch. Mithilfe der Toluidinblau-Färbung (TB) am 28. und 56. Tag nach tMCAO stellten wir fest, dass nur die Kombinationen His 1000–200 und 1000–500 die Infarktfläche deutlich reduzierten (Abb. 2A, C: n = 10–12; Abb . 2E: n = 6–7). Der Glia-Narbenbereich um den Infarktkern wurde anhand der histochemischen GFAP-Diaminobenzidin-Färbung quantifiziert. Nur die Behandlung mit His 1000–500 reduzierte die Glia-Narbenfläche am 28. und 56. Tag nach der Ischämie deutlich (Abb. 2B, D: n = 10–12; Abb. 2F: n = 6–7). Zwischen der tMCAO-Gruppe und anderen Histidin-Behandlungsgruppen konnte keine statistisch signifikante Veränderung der Glia-Narbenfläche festgestellt werden. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Histidin nach zerebraler Ischämie einen langfristigen Neuroschutz bietet und die Behandlung mit His 1000–500 den stärksten Schutz für die neurologische Funktion und eine Verringerung der Glia-Narbenbildung zeigte.

Histidin reduziert die Infarktfläche und die Glia-Narbenfläche nach fokaler zerebraler Ischämie.

Unter den verschiedenen Histidin-Behandlungsschemata wurde die Infarktfläche mit TB-Färbung am 28. Tag (C) und 56. Tag (E) nach tMCAO geschätzt, wobei die repräsentative Schicht in (A) dargestellt ist. Die Glia-Narbenfläche wurde auch mit GFAP-Färbung am 28. Tag (D) und 56. Tag (F) nach tMCAO geschätzt, wobei das repräsentative Foto in (B) gezeigt wird (B1 zeigt die quantifizierte Fläche; B2-B5 zeigt den vergrößerten Glia-Narbenrand ). n = 10–12 für C und D; n = 6–7 für E und F. B1: bar = 500 μm; B2–5: bar = 100 μm. *P < 0,05, ***P < 0,001, verglichen mit der tMCAO-Gruppe.

Die Bildung von Glia-Narben resultiert in der Regel aus morphologischen und funktionellen Veränderungen von Astrozyten, zu denen die Aktivierung mit GFAP-Hochregulierung, Proliferation sowie Migration zum Rand der Läsion gehört21,22, sodass die Verringerung der Glia-Narbenfläche durch Histidin möglicherweise damit zusammenhängt Aspekte. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Aktivierung von Astrozyten im Halbschattenbereich mittels Immunhistochemie und Western Blot untersucht. Nach der zerebralen Ischämie wurden die Astrozyten mit erhöhter GFAP-Expression deutlich aktiviert. Die Behandlung mit His 1000 hatte jedoch 7 Tage nach der Ischämie keinen weiteren Einfluss auf die Aktivierung der Astrozyten, ebenso wenig wie die Behandlungen mit His 1000–0 und 1000–500 14 Tage danach Ischämie (Ergänzung Abb. 2; n = 6–7). Anschließend wurde die Proliferation von Astrozyten anhand der Quantifizierung von BrdU+/GFAP+-Zellen im Halbschattenbereich bewertet. Obwohl die Anzahl der BrdU+-Zellen nach der Behandlung mit His 1000–500 zunahm, blieb die Anzahl der BrdU+/GFAP+-Zellen unverändert (Ergänzung Abb. 3; n = 6–7), was darauf hindeutet, dass Histidin keinen Einfluss auf die Proliferation von Astrozyten hat. Der Wundheilungstest in kultivierten Astrozyten ermöglicht es uns, die direkte Wirkung von Histamin auf die Aktivierung, Proliferation und Migration von Astrozyten zu analysieren. Die GFAP-Expression und die Anzahl der BrdU+-Zellen blieben an der Wundgrenze nach der Histaminbehandlung unverändert (Ergänzung Abb. 4). Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Regulierung der Aktivierung und Proliferation von Astrozyten zur Verringerung der Glia-Narbenfläche durch Histidin beitrug.

Um zu untersuchen, ob die Wirkung von Histidin auf die Astrozytenmigration auf die Verringerung der Glia-Narbenfläche zurückzuführen ist, wurde die Verteilung der Astrozyten durch Messung der von reaktiven Astrozyten umgebenen Infarktfläche quantifiziert. Am 7. Tag nach der Ischämie gab es keinen Unterschied in der Größe des Infarktbereichs zwischen der Kontrollgruppe und den His 1000-Gruppen, während am 14. Tag nach der Ischämie der Infarktbereich in der His 1000–500-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen deutlich reduziert war (33,7 ± 2,1 % vs. 49,0 ± 2,3 %, P < 0,001; Abb. 3A, B; n = 6–8), was darauf hindeutet, dass Histidin die Wanderung von Astrozyten zum Infarktkern im späten Behandlungsstadium nach zerebraler Ischämie erleichtert. Die Tatsache, dass die Infarktfläche am 14. Tag in der His 1000–0-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen unverändert blieb, legt nahe, dass die Behandlung mit Histidin im Spätstadium für die Migration von Astrozyten in Richtung Infarktkern unverzichtbar war (43,7 ± 2,7 % vs. 49,0 ± 2,3). %; Abb. 3A,B; n = 6–8), was später zu einer dünneren Narbenbarriere führen könnte (Abb. 2B,D,F).

Histidin fördert die Migration reaktiver Astrozyten zum Infarktkern.

Die GFAP-Immunfärbung wurde 7 Tage und 14 Tage nach tMCAO durchgeführt (A) und der von reaktiven Astrozyten umgebene Infarktbereich wurde quantifiziert (B). Die Morphologie von Astrozyten am Glia-Narbenrand, die durch Pfeile in A angezeigt wird, wurde in C1–3 gezeigt, mit vergrößerten Bildern in C4–6 (GFAP: grün; DAPI: blau). Pfeile in C4–6 zeigen die polarisierten Astrozyten an. Die Länge (D), die Breite (E), das Verhältnis von Länge zu Breite der Vorsprünge (F) und der Prozentsatz polarisierter Astrozyten (G) wurden am Rand der Glia-Narbe 14 Tage nach tMCAO quantifiziert. n = 6–8. A: Balken = 1 mm; C1–3: bar = 100 μm; C4–6: bar = 50 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, verglichen mit der tMCAO-Gruppe, #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, verglichen mit der His 1000–0-Gruppe.

Die Zellmigration ist ein hoch orchestrierter mehrstufiger Prozess. Um zu migrieren, nimmt eine Zelle als Reaktion auf extrazelluläre Signale zunächst eine charakteristische polarisierte Morphologie an, die durch eine verlängerte Vorwölbung gekennzeichnet ist19. Wir analysierten die Morphologie von Astrozyten am Rand der Glia-Narbe (Abb. 3C–G; n = 6–8) und stellten fest, dass die Behandlung mit His 1000–500, aber nicht mit His 1000–0 die relative Länge von (1,36 ± 0,10 vs . 1,00 ± 0,03; P < 0,01), verringerte jedoch die relative Breite der Astrozytenvorsprünge (0,66 ± 0,05 gegenüber 1,00 ± 0,05; P < 0,01) und erhöhte somit das Verhältnis von Länge zu Breite (2,22 ± 0,34 gegenüber 1,00 ± 0,04). ; P < 0,01). Darüber hinaus stieg der Prozentsatz polarisierter Zellen mit dem Kriterium, dass die Länge des Vorsprungs die Breite um mindestens das Vierfache überstieg, in der Behandlungsgruppe His 1000–500 (40,1 ± 2,7 vs. 21,9 ± 2,4; P < 0,001).

Um die Wirkung von Histamin auf die Astrozytenmigration zu bestätigen, wurde die Migrationsstrecke durch einen Wundheilungstest bestimmt (Abb. 4A, B; aus 3–4 unabhängigen Experimenten). Histamin steigerte die Migration von Astrozyten an der Wundgrenze erheblich, wobei die Dosis von 10–7 mol/L den maximalen Effekt zeigte (1,86 ± 0,10 vs. 1,00 ± 0,06; P < 0,001). Im Transwell-Migrationstest, einem weiteren gängigen Test für die Zellmigrationsreaktion, stellten wir erneut fest, dass nach der Verabreichung von Histamin mehr migrierte Zellen auftraten (Abb. 4D, F; aus 3–4 unabhängigen Experimenten). Die 10–7 mol/L Histamin zeigten die maximale Förderung der Astrozytenmigration (1,67 ± 0,03 vs. 1,00 ± 0,10; P < 0,001), wohingegen dieser Effekt mit zunehmender Dosis verringert wurde.

Histamin fördert die Astrozytenmigration im Wundheilungstest und im Transwell-Migrationstest in vitro.

Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen zeigen die Migration von Astrozyten unter der Behandlung mit Histamin (HA) 10–7 mol/L 0 h, 24 h und 48 h nach dem Kratzer (A, weiße Linien zeigen Wundränder an). Die Migrationsstrecke wurde unter den verschiedenen Histaminkonzentrationen 24 Stunden nach dem Kratzer quantifiziert (B). Die Wirkung von Histamin auf die Astrozytenmigration wurde auch im Transwell-Migrationstest (F) analysiert, mit repräsentativen Bildern von migrierten Astrozyten unter der Behandlung von Histamin 10–7 mol/L (D). Zellen mit Lamellipodien an der Wundgrenze wurden 2 Stunden oder 4 Stunden nach dem Kratzen unter Behandlung mit 10–7 mol/L Histamin (G) gezählt, wobei repräsentative Bilder mit Rhodamin-Phalloidin gefärbt wurden, um F-Aktin (C) zu zeigen, Pfeile zeigen Zellen an mit Lamellipodien). 24 Stunden nach dem Kratzen wurden die Zellen unter der Behandlung mit 10–7 mol/L Histamin mit GFAP in Grün und DAPI in Blau gefärbt. Die Morphologie der Astrozyten an der Wundgrenze wurde analysiert, einschließlich der Länge (H), der Breite (I), des Verhältnisses von Länge zur Breite der Vorsprünge (J) und des Prozentsatzes polarisierter Astrozyten (K). Die repräsentativen Bilder sind in dargestellt (E). Der Prozentsatz der Astrozyten, die 30 Minuten nach dem Ausplattieren an Poly-L-Lysin und Laminin anhafteten, wurde in L quantifiziert. Die Werte stammen aus 3 bis 4 unabhängigen Experimenten. C: Balken = 50 μm; D, E: bar = 100 μm. *P < 0,05, **P < 0,01,***P < 0,001, verglichen mit der Kontrollgruppe (CON).

An der Zellfront treibt die Aktin-Assemblierung die Ausdehnung flacher Membranvorsprünge, sogenannte Lamellipodien, voran, was zur Zellpolarisierung für die Migration beiträgt23. Wie eine Färbung von filamentösem Aktin (F-Aktin) zeigt, erhöhte Histamin den Prozentsatz der Zellen mit Lamellipodien an der Wundgrenze (Abb. 4C, G). Anschließend untersuchten wir die Morphologie der Astrozyten an der Wundgrenze durch GFAP-Immunfärbung. Wie in Abb. 4E, H–K (aus 3–4 unabhängigen Experimenten) gezeigt, erhöhte Histamin ähnlich wie in vivo die relative Länge der Vorsprünge deutlich (1,38 ± 0,02 vs. 1,00 ± 0,02; P < 0,001), Verhältnis von Länge zur Breite der Vorsprünge (1,85 ± 0,06 vs. 1,00 ± 0,04; P < 0,001), Prozentsatz polarisierter Zellen (77,5 ± 3,3 vs. 31,9 ± 2,5; P < 0,001), verringerte jedoch die relative Breite der Vorsprünge (0,75 ± 0,02). vs. 1,00 ± 0,04; P < 0,001). Nach der Polarisation bilden Zellen Adhäsionen, die die extrazelluläre Matrix mit dem Aktin-Zytoskelett verbinden, um den Vorsprung zu verankern und den Zellkörper zu bewegen. Daher könnte die Veränderung der Adhäsion auch die Migration beeinflussen24. Unsere Studie zeigte jedoch, dass die Adhäsionsfähigkeit von Astrozyten nach der Histaminbehandlung unverändert blieb, was entweder auf einer mit Poly-L-Lysin oder Laminin beschichteten Oberfläche getestet wurde (Abb. 4L). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass Histamin die Migration von Astrozyten zum Infarktkern erleichtert, wahrscheinlich durch die Förderung der Astrozytenpolarisierung.

Sowohl Histamin-H1- als auch H2-Rezeptoren wurden in Astrozyten gefunden25,26, ihre genauen Funktionen sind jedoch weitgehend unbekannt. Wir fanden heraus, dass der H2-Agonist Amthamin im Wundheilungstest eine ähnliche Wirkung wie Histamin auf die Migration von Astrozyten hatte, während der H2-Antagonist Cimetidin und Famotidin beide die fördernde Wirkung von Histamin auf die Astrozytenmigration aufhoben (Abb. 5A; aus 3–4 unabhängigen Experimenten). Andererseits kann der H1-Antagonist Pyrilamin die oben genannte Wirkung von Histamin nicht hemmen (Beilage Abb. 5). PKA befindet sich im Downstream-Signalweg der Aktivierung des Histamin-H2-Rezeptors27. Wir fanden heraus, dass der PKA-Inhibitor Rp-cAMP auch die Histamin-geförderte Astrozytenmigration umkehrte (Abb. 5A; aus 3–4 unabhängigen Experimenten), was die Beteiligung des H2-Rezeptors an der Wirkung von Histamin auf die Astrozytenmigration weiter bestätigte. Darüber hinaus hatte die alleinige Gabe von Cimetidin, Famotidin, Pyrilamin und Rp-cAMP keinen Einfluss auf die Migration von Astrozyten.

Histidin fördert die Migration von Astrozyten und sorgt über den H2-Rezeptor für Neuroprotektion.

Im Wundheilungstest wurden nach dem Kratzer Cimetidin (Cime) in einer Menge von 10–7 mol/L, Famotidin (Famo) in einer Menge von 10–7 mol/L oder Rp-cAMP in einer Menge von 10–5 mol/L nach dem Kratzer verabreicht, während 10–7 mol/L verabreicht wurden 30 Minuten später wurden 7 mol/L Histamin (HA) oder 10–8 mol/L Amthamin (Amth) hinzugefügt. Ihre Auswirkungen auf die Astrozytenmigration wurden in (A) gezeigt. Cimetidin-Behandlungen wurden außerdem in zwei Phasen (erste Woche und spätere Woche) unterteilt, in denen Cimetidin entweder nicht oder in einer Dosis von 20 oder 100 mg/kg 30 Minuten vor jeder Histidin-Injektion verabreicht wurde, einschließlich Cime 20–20, Cime 100–100, Cime 0–100 und Cime 100–0. Die Morphologie der Astrozyten vom Glia-Narbenrand 14 Tage nach tMCAO wurde in B gezeigt (GFAP: grün; DAPI: blau). Die Länge (C), die Breite (D), das Verhältnis von Länge zu Breite der Vorsprünge (E) und der Prozentsatz der polarisierenden Astrozyten (F) wurden quantifiziert. Der von reaktiven Astrozyten umgebene Infarktbereich wurde in (G) quantifiziert. Der neurologische Defizit-Score wurde am 1., 3., 7. und 14. Tag nach tMCAO (H) ausgewertet, während die Infarktfläche auch mittels TB-Färbung (I) geschätzt wurde. A: Die Werte liegen zwischen 3 und 4 unabhängigen Experimenten. B–I: n = 10–12. Balken = 50 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, verglichen mit der Kontrollgruppe (A) oder der tMCAO-Gruppe (C–I) an jedem Testtag oder jedem Test; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, verglichen mit Histamin oder His 1000–500-Gruppe an jedem Testtag oder jedem Test.

Um die Beteiligung des H2-Rezeptors an den Wirkungen von Histidin in vivo zu überprüfen, wurde Cimetidin vor jeder Histidin-Behandlung injiziert (Abb. 5B – I). Wir fanden heraus, dass die Polarisation von Astrozyten am Rand der Glia-Narbe auch durch die Injektion von Cimetidin (100 mg/kg) während 0–14 Tagen oder 7–14 Tagen abgeschwächt wurde (bezogen auf die Kombinationen Cime 100–100 bzw. Cime 0–100). Dies zeigte sich im Vergleich zur Behandlung mit His 1000–500 allein in einer kürzeren Länge der Vorsprünge und einem verringerten Prozentsatz polarisierter Zellen, aber einer größeren Breite der Vorsprünge (Abb. 5B–F; n = 10–12). Die Verringerung der von reaktiven Astrozyten umgebenen Infarktfläche nach der Behandlung mit His 1000–500 wurde auch durch die Injektion von Cimetidin (100 mg/kg) während 0–14 Tagen oder 7–14 Tagen nach der Ischämie aufgehoben (Abb. 5G; n = 10–12). ). Die Behandlung mit Cimetidin während 0–7 Tagen (100 mg/kg, bezogen auf Cime 100–0-Kombinationsbehandlung) hatte jedoch keine solche Wirkung, was darauf hindeutet, dass die Blockierung des H2-Rezeptors, insbesondere im Spätstadium, die Förderung der Astrozytenmigration durch Histidin umkehrte .

Der neurologische Defizit-Score und die Infarktfläche wurden auch nach der Cimetidin-Injektion bewertet (Abb. 5H, I; n = 10–12). Auch hier kehrte die Injektion von Cimetidin (100 mg/kg) während 0–14 Tagen oder 7–14 Tagen, jedoch nicht 0–7 Tagen, die Histidin-induzierte Verringerung des neurologischen Defizit-Scores um, der 14 Tage nach der zerebralen Ischämie ermittelt wurde, als die Astrozyten wanderten ist ebenfalls aufgetreten (Abb. 5H; n = 10–12). Parallel dazu wurde die durch Histidin bewirkte Verringerung der Infarktfläche durch die Injektion von Cimetidin (100 mg/kg) während 0–14 Tagen oder 7–14 Tagen aufgehoben (Abb. 5I; n = 10–12). Andererseits hat der H1-Rezeptorantagonist Pyrilamin keinen Einfluss auf die Wirkung von Histidin auf die Astrozytenpolarisation (Ergänzung Abb. 5). Diese Daten deuten darauf hin, dass die fördernde Wirkung von Histamin auf die Astrozytenmigration durch den H2-Rezeptor vermittelt wird, der zu seiner neuroprotektiven Wirkung beitragen kann.

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Rho-GTPasen, darunter RhoA, Rac1 und CDC42, entscheidend für die Signalwege sind, die der Etablierung der Polarisation vor der Zellmigration zugrunde liegen, wobei Rac1 vermutlich der Hauptaktivator bei der Bildung von Lamellipodien ist23. Wir fanden heraus, dass Histamin den Spiegel an aktivem Rac1 erhöhte, wie durch den GTPase-Pulldown-Assay untersucht, der GTP-gebundenes Rac1 testet, während Cimetidin und Rp-cAMP beide die Hochregulierung von Rac1 durch Histamin aufhoben (Abb. 6A; von 3–4). unabhängige Experimente). Darüber hinaus kehrte der Rac1-Inhibitor NSC23766 die Histamin-induzierte Förderung der Astrozytenmigration um (Abb. 6B; aus 3–4 unabhängigen Experimenten), was darauf hindeutet, dass Histamin die Astrozytenmigration über den H2-Rezeptor und die anschließende Hochregulierung von aktivem Rac1 erleichtern könnte.

Die Hemmung der kleinen GTPase Rac1 behindert die Migration von Astrozyten und die durch Histidin bereitgestellte neurologische Erholung.

Im Wundheilungstest wurden Cimetidin (Cime, 10–7 mol/L) oder Rp-cAMP (10–5 mol/L), Rac1-Inhibitor NSC 23766 in der angegebenen Konzentration nach dem Kratzer verabreicht, während 10–7 mol/L Histamin (HA) wurde 30 Minuten später hinzugefügt. Die GTP-gebundene kleine GTPase Rac1 wurde 24 Stunden nach dem Scratchen durch Western-Blot-Analyse untersucht (A). Die Quantifizierung der Migrationsstrecke 24 Stunden nach dem Kratzer wurde in B gezeigt. Nach tMCAO wurden 50 μg NSC23766 30 Minuten vor jeder Histidininjektion von 7 bis 14 Tagen nach tMCAO in den Hirnventrikel abgegeben. Seine Auswirkungen auf den von reaktiven Astrozyten umgebenen Infarktbereich und auf die Morphologie der Astrozyten am Glia-Narbenrand 14 Tage nach tMCAO wurden in (C,D) mit GFAP-Immunfärbung (GFAP: grün; DAPI: blau) gezeigt. Die Länge (E), die Breite (F), das Verhältnis von Länge zu Breite der Vorsprünge (G) und der Prozentsatz polarisierter Astrozyten (H) wurden quantifiziert. Der neurologische Defizit-Score (I) wurde am 1., 3., 7., 14. und 28. Tag nach tMCAO ausgewertet, während die kognitiven Fähigkeiten durch einen kontextuellen und stichhaltigen Angstkonditionierungstest (Tag 27, J) und den Morris-Wasserlabyrinth bewertet wurden (Tag 22–24, K) mit repräsentativen Schwimmwegen (Tag 24, der graue Kreis zeigt die Position der Plattform an). Die Glia-Narbenfläche (L) und die Infarktfläche (M) aus der TB-Färbung wurden 28 Tage nach tMCAO bestimmt. A und B: Werte liegen zwischen 3 und 4 unabhängigen Experimenten; C–L: n = 10–12. D: Balken = 50 μm; L: bar = 100 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, verglichen mit der Kontrollgruppe (A,B) oder der Scheingruppe (J,K) an jedem Testtag oder jedem Test; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, verglichen mit Histamin-Behandlungsgruppe A und B) oder tMCAO-Gruppe (C–M); &P < 0,05, &&P < 0,01, &&&P < 0,001, verglichen mit seiner 1000–500-Gruppe an jedem Testtag oder jedem Test.

Um die Beteiligung der Astrozytenmigration an der Schutzwirkung von Histidin weiter zu verifizieren, wurde der Rac1-Inhibitor NSC23766 7–14 Tage nach tMCAO in den Hirnventrikel abgegeben. Während dieser Zeit wanderten die Astrozyten in Richtung des Infarktkerns (Abb. 3A, B). Der von reaktiven Astrozyten umgebene Infarktbereich wurde nach der Verabreichung von NSC23766 zusammen mit der Histidinbehandlung vergrößert (Abb. 6C; n = 10–12). Die Polarisation von Astrozyten wurde auch durch NSC23766 aufgehoben, was durch die Zunahme der Länge, des Verhältnisses von Länge zur Breite der Vorsprünge und des Prozentsatzes polarisierender Zellen, aber durch die Abnahme der Breite des Vorsprungs gezeigt wird (Abb. 6D – H; n = 10–12), was darauf hindeutet, dass NSC23766 die Histidin-hochregulierte Astrozytenmigration hemmen kann. NSC23766 kehrte auch die Histidin-induzierte Verbesserung der neurologischen Funktion nach zerebraler Ischämie um (Abb. 6I; n = 10–12). Im Angstkonditionierungstest und im Morris-Wasserlabyrinthtest kehrte NSC23766 die durch Histidin vermittelte Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten deutlich um (Abb. 6J, K; n = 10–12). Darüber hinaus hob NSC23766 die Histidin-induzierte Verringerung der Glia-Narbenfläche (Abb. 6L; n = 10–12; 0,58 ± 0,03 vs. 0,39 ± 0,03; P < 0,001) und der Infarktfläche auf, wie durch TB-Färbung angezeigt (Abb. 6M). ; n = 10–12; 38,9 ± 4,2 vs. 27,5 ± 2,4; P < 0,05). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Migration von Astrozyten für die neuroprotektive Wirkung von Histidin nach zerebraler Ischämie entscheidend ist.

Es wurde berichtet, dass Histamin im Frühstadium nach einer zerebralen Ischämie einen Neuroprotektionseffekt bietet, was auf seine Wirkung auf Neuronen, Astrozyten oder Entzündungszellen zurückgeführt wird28. Histidin und sein Vorläufer Carnosin wirken mit ihren antioxidativen und antiapoptotischen Eigenschaften auch in einem sehr frühen Stadium nach Beginn einer zerebralen Ischämie direkt neuroprotektiv29,30. Die Wirkung von Histamin oder verwandten Wirkstoffen im Spätstadium nach einer zerebralen Ischämie wurde jedoch nicht untersucht. Hier haben wir durch Verhaltens- und pathologische Untersuchungen herausgefunden, dass Histidin, der Vorläufer von Histamin, dosis- und stadienabhängig einen langfristigen Neuroschutz bietet. Dieser Schutz kann größtenteils auf die Einschränkung der Glia-Narbenbildung durch die Förderung der Astrozytenmigration zurückzuführen sein. Unsere Studie beleuchtet die Regulierung der Astrozytenfunktion als therapeutische Strategie für durch zerebrale Ischämie verursachte Hirnverletzungen.

Basierend auf den Ergebnissen von Verhaltenstests, pathologischen Untersuchungen und In-vitro-Experimenten (Abb. 1, 2 und 4) wurde das dosis- und stadienabhängige Behandlungsschema mit Histidin wie folgt vorgeschlagen: 1) Histidin in einer konstanten Dosis von 1000 mg/kg verbesserte neurologische Funktion, die jedoch nicht so bemerkenswert ist wie die Behandlung mit dosis- und stadienabhängigem Schema; 2) Histidin (1000 mg/kg) hat nur im frühen Stadium (bezieht sich auf die His 1000–0-Gruppe) keine schützende Wirkung auf das neurologische Defizit und das Angstgedächtnis im späten Stadium; 3) Histidin in einer hohen Dosis von 1000 mg/kg im Frühstadium und einer niedrigen Dosis von 200 oder 500 mg/kg im Spätstadium führte zu einem überlegenen Schutz hinsichtlich der neurologischen Funktion und des Infarktbereichs, darunter das Regime mit einer Dosis von 500 mg/kg Das Spätstadium hat die stärkste Schutzwirkung, wohingegen eine Behandlung mit umgekehrter Dosisreihenfolge mit niedriger Dosis im Frühstadium, aber hoher Dosis im Spätstadium keinen Schutz bietet (Daten nicht gezeigt); 4) nur die Behandlung mit His 1000–500 reduzierte den Glia-Narbenbereich; 5) Die Förderung der Astrozytenmigration in vitro nimmt mit zunehmender Histamindosis ab, was darauf hindeutet, dass eine hohe Histamindosis der Astrozytenmigration, die im Spätstadium stattfindet, möglicherweise keinen Nutzen bringt. Daher legt unsere Studie nahe, dass die dosis- und stadienabhängige Behandlungsstrategie für die Therapie der zerebralen Ischämie wirksam ist.

Die zugrunde liegenden Faktoren, die zur Schutzwirkung dieser dosis- und stadienabhängigen Therapie beitragen, können kompliziert sein, wahrscheinlich aufgrund der vielfältigen Wirkungen gegen durch zerebrale Ischämie verursachte Hirnverletzungen. Histidin in einer Dosis von 1000 mg/kg, das in einem frühen Stadium nach Beginn der Ischämie verabreicht wird, reduziert das Infarktvolumen und den neuronalen Tod und seine Auswirkungen auf das neuronale Überleben, die Glutamat-Clearance in Astrozyten und die Hemmung der Infiltration entzündlicher Zellen werden als zugrundeliegende Mechanismen angesehen11,28. Diese akuten oder subakuten Ereignisse treten normalerweise innerhalb von Tagen oder einer Woche nach der Ischämie auf, wobei die Rettung von Astrozyten in diesem Stadium oft eine vorteilhafte Rolle spielt, wohingegen Astrozyten nach und nach eine feste Barriere bilden, um danach den neuronalen Wiederaufbau zu behindern. Obwohl kein striktes Behandlungsschema auf der Grundlage eines zeitlichen Verlaufs untersucht wurde, reduzierte Histidin unter der derzeitigen Kombinationstherapie mit hoher und niedriger Dosierung die Barriere zur Bildung von Glia-Narben deutlich, was möglicherweise der Grund für seinen herausragenden langfristigen Schutz vor Verhaltensstörungen und Infarkten ist. Daher kann das histaminerge System wahrscheinlich ein vielversprechendes therapeutisches Ziel sein, da es die Astrozytenwirkungen nach zerebraler Ischämie dosis- und stadienabhängig orchestriert.

Darüber hinaus zeigte unsere Studie, dass Histidin oder Histamin keinen Einfluss auf die Proliferation und Aktivierung hatten (Ergänzung, Abbildungen 2–4), sondern nur auf die Migration von Astrozyten (Abb. 3), was zu einer dünneren Glia-Narbenbarriere führte (Abb. 2B, D). ,F und 6L). Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Förderung der Astrozytenmigration zum Schutz beiträgt, was sich daran zeigt, dass die Blockierung der Astrozytenmigration durch NSC23766 den Histidin-induzierten Neuroprotektionsschutz aufhob (Abb. 6). Andere Studien deuteten ebenfalls auf einen Beitrag der Astrozytenmigration zur Neuroprotektion hin. Bei Rückenmarksverletzungen wurde eine positive Wirkung nach der Stimulation wandernder Astrozyten durch Hemmung der Glykogensynthasekinase-3 beobachtet31. Darüber hinaus sorgt Adrenomedullin für Neuroprotektion gegen durch zerebrale Ischämie verursachte Verletzungen und fördert gleichzeitig die Migration von Astrozyten32. Zu beachten ist, dass diese Migration oft als Bewegung oder Verschiebung von Astrozyten in Richtung des Infarktkerns bezeichnet wird, was sich von der Wanderung von Astrozyten zur Bildung von Glianarben unterscheiden kann, bei denen sich Astrozyten im Halbschattenbereich ansammeln.

Eine direkte Sorge hinsichtlich der Vorteile der Astrozytenmigration könnte sein, dass sie zu einer verdichteten Glia-Narbe führt, die eine dünnere Barriere bildet (Abb. 2B, D, F und 6L) und einen größeren Halbschattenbereich ohne Glia-Narbe erzeugt (Abb. 3A, B und 6C). ), um die Neurogenese im Halbschattenbereich zu unterstützen. Diese Annahme ist plausibel, da nach der Histidinbehandlung, die durch den Rac1-Inhibitor NSC 23766 zusammen mit der Blockade der Astrozytenmigration aufgehoben wurde, mehr neugeborene Neuronen am Rand der Glianarbe gefunden wurden (Ergänzung Abb. 6). Außerdem können die migrierten Astrozyten die Entzündungszellen in den Infarktkern einschnüren, was bei Rückenmarksverletzungen bestätigt wurde31. Darüber hinaus ist anzumerken, dass die Kontrolle der Glia-Narbenbildung durch Manipulation der Astrozytenmigration ein überlegener Ansatz zur Erzielung von Neuroprotektion sein kann, da andere Wege, um eine geringere Glia-Narbenbildung zu erreichen, wie z. B. die Hemmung der Astrozytenaktivierung und -proliferation, die normale Funktion von Astrozyten beeinträchtigen können bewirken, dass sich der Läsionsbereich im Frühstadium der Ischämie ausbreitet. Tatsächlich vergrößerte die Ablation der Astrozytenaktivierung durch Verwendung von Astrozyten-GFAP und Vimentin-Double-Knockout-Mäusen das Infarktvolumen, was möglicherweise mit den Veränderungen des Glutamattransports, der Gap Junctions und der Plasminogenaktivator-Inhibitor-1-Expression in Astrozyten zusammenhängt33.

Die Astrozytenmigration wird durch H2-Rezeptoren vermittelt, wie in unserer Untersuchung durch die Anwendung von Antagonisten und Agonisten des H2-Rezeptors und durch die Blockierung seines Signalwegs in vitro gezeigt wurde (Abb. 5). Darüber hinaus hemmte der H2-Antagonist, jedoch nicht der H1-Antagonist, auch die Astrozytenmigration und kehrte die Histidin-induzierte Verringerung der Infarktfläche um. Zu beachten ist, dass während des gesamten Behandlungsverlaufs mit dem H2-Antagonisten ähnliche Effekte wie die oben beschriebenen nur im späten Stadium nach der zerebralen Ischämie beobachtet wurden, in dem sich die Astrozytenmigration entwickelt. Somit erleichtert die Aktivierung des H2-Rezeptors in Astrozyten die Migration der Astrozyten in Richtung des Infarktbereichs und verleiht zumindest im Spätstadium nach zerebraler Ischämie Neuroprotektion, während der H1-Rezeptor wahrscheinlich nicht beteiligt ist (Ergänzung Abb. 5).

Die vielfältigen Wirkungen von Histamin nach zerebraler Ischämie beruhen möglicherweise weitgehend auf der Beteiligung seiner zahlreichen Rezeptoren wie H1- und H2-Rezeptoren, die über unterschiedliche Wirkungen auf verschiedene Zellen wirken12,28,34,35. Unsere Studie ergab eine neuartige Wirkung von Histamin auf die Migration von Astrozyten durch den H2-Rezeptor, um einen langfristigen Neuroschutz zu gewährleisten. Darüber hinaus kann eine direkte Wirkung von Histidin auf kognitive Beeinträchtigungen nach zerebraler Ischämie nicht ausgeschlossen werden, da Histamin nachweislich das Lernen und das Gedächtnis verbessert36,37,38. Die Abgabe von Histamin im Hippocampus lindert räumliche Gedächtnisdefizite bei der Aufgabe des radialen Armlabyrinths über H1- und H2-Rezeptoren36. Bilaterale Post-Training-Injektionen der H2-Rezeptoragonisten Amthamin oder RAMH in den dorsalen Hippocampus erleichtern die Gedächtniskonsolidierung nach kontextueller Angstkonditionierung37. Daher können Histamin oder verwandte Wirkstoffe potenzielle Kandidaten für die funktionelle Wiederherstellung während einer langfristigen zerebralen Ischämieverletzung sein.

Rho-GTPasen spielen eine zentrale Rolle bei der Zellmigration, darunter die durch Rac1 induzierte Lamellipodienbildung38. Ein hoher Anteil an polarisierten Astrozyten und der Bildung von Lamellipodien wurde in mit Histamin behandelten kultivierten Astrozyten oder in Glia-Narbenrändern im Gewebe von mit Histidin behandelten Ratten beobachtet. Darüber hinaus wurde die aktive GTP-gebundene kleine GTPase Rac1 durch Histamin hochreguliert, was durch Cimetidin oder Rp-cAMP umgekehrt werden kann. NSC 23766, ein Rac1-spezifischer Inhibitor, hob die Histamin-induzierte Förderung der Astrozytenmigration auf. Daher fördert Histamin die Migration von Astrozyten in Richtung des Infarktbereichs durch den H2-Rezeptor und die anschließende Aktivierung von Rac1, was unser Wissen über die Rolle von Histamin bei der Migration von Astrozyten im ZNS erweitert.

Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass eine dosis- und stadienabhängige Behandlung mit Histidin die Migration von Astrozyten in Richtung des Infarktbereichs durch den H2-Rezeptor und die anschließende Hochregulierung von aktivem Rac1 fördert, was der langfristigen Wiederherstellung der neurologischen Funktion nach zerebraler Ischämie zugute kommt. Es deutet auch darauf hin, dass die gezielte Behandlung des histaminergen Systems eine neue Therapiestrategie für langfristige, durch zerebrale Ischämie verursachte Schäden durch seine Wirkung auf Astrozyten sein könnte.

Die männlichen Sprague-Dawley (SD)-Ratten mit einem Gewicht von 250–280 wurden für In-vivo-Experimente und die neugeborenen SD-Ratten für Experimente mit Astrozytenkulturen verwendet. Alle Experimente wurden vom Tierversuchsausschuss der Universität Zhejiang genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien durchgeführt und entsprachen vollständig dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Es wurden Anstrengungen unternommen, um jegliche Schmerzen und Unannehmlichkeiten zu minimieren, und es wurde die minimale Anzahl an Tieren verwendet. In allen folgenden Experimenten wurden die Tiere randomisiert in Kontroll- und Behandlungsgruppen eingeteilt.

Die Ratten wurden durch intraperitoneale Injektion von Choralhydrat (350 mg/kg) anästhesiert. Eine vorübergehende fokale zerebrale Ischämie wurde durch tMCAO induziert, wie zuvor beschrieben39. Kurz gesagt wurde ein 6–0-Nylon-Monofilamentfaden, der an der Spitze abgestumpft und mit 1 % Poly-L-Lysin beschichtet war, 18 mm in die innere Halsschlagader vorgeschoben, um den Ursprung der mittleren Hirnarterie (MCA) zu verschließen. Der zerebrale Blutfluss (CBF) im Gebiet der mittleren Hirnarterie wurde mittels Laser-Doppler-Durchflussmessung40 (Periflux System 5010; Perimed, Jarfalla, Schweden) bestimmt. Eine flexible faseroptische Sonde wurde am Schädel über der Kortikalis befestigt, die vom proximalen Teil des rechten MCA versorgt wird (2 mm kaudal zum Bregma und 6 mm lateral zur Mittellinie). Tiere mit einer CBF-Reduktion von <80 % im Kern des MCA-Territoriums wurden von der Studie ausgeschlossen. Nach 90-minütiger Okklusion wurde die Reperfusion durch Entfernen des Monofilaments durchgeführt. Die Ratten, deren CBF nach der Reperfusion nicht 60 % des vorherigen CBF vor dem Verschluss erreichte, wurden ausgeschlossen. Die Körpertemperatur wurde während der Operation und für 2 Stunden nach Beginn der Reperfusion mit einer Wärmelampe (FHC, Bowdoinham) auf 37 °C gehalten.

Es gab 4 separate Experimente. In jedem Fall wurden die Ratten wie folgt randomisiert der Behandlungsgruppe zugeteilt (Ergänzung Abb. 7). In Experiment 1 erhielten Ratten in der ersten Woche 200, 500 oder 1000 mg/kg Histidin. In Experiment 2 erhielten Ratten in der ersten Woche 1000 mg/kg Histidin, in den späteren Wochen jedoch 0, 200, 500 oder 1000 mg/kg Histidin, die als His 1000–0, His 1000–200, His 1000–500 oder bezeichnet werden Seine 1000–1000 Gruppen. Zur Histidinbehandlung wurde Histidin (Sigma, USA) in normaler Kochsalzlösung gelöst und 0 h, 6 h und jeden zweiten Tag nach tMCAO intraperitoneal injiziert. Für die Kontrollen wurde Ratten das gleiche Volumen Kochsalzlösung injiziert. In Experiment 3 wurden neben der His 1000–500-Behandlung auch die Cimetidin-Behandlungen in zwei Phasen (erste Woche und spätere Woche) unterteilt, in denen Cimetidin (20 oder 100 mg/kg) 30 Minuten vor jeder Histidin-Injektion intraperitoneal verabreicht wurde, einschließlich Cime 20–20, Cime 100–100, Cime 0–100 und Cime 100–0. Experiment 4, zusammen mit His 1000–500-Behandlung, wurde der Rac1-Inhibitor NSC 23766 (50 μg) 30 Minuten vor jeder Histidin-Injektion in der zweiten Woche nach tMCAO an den kontralateralen Ventrikel abgegeben. Die neurologische Funktion wurde am 1., 3., 7., 14., 28., 42. und 56. Tag nach tMCAO39 sowie die kognitiven Fähigkeiten im Morris-Wasserlabyrinth (Tag 22–25, Tag 50–53) und die kontextuelle Angstkonditionierung (Tag 26–27) bewertet. Tag 54–55) wurden vor der Tötung ausgewertet41,42,43. Ratten wurden 7, 14, 28 oder 56 Tage nach tMCAO für Immunhistochemie, Western Blot oder TB-Färbung getötet. Die Anzahl der Einschluss- und Ausschlusstiere für jede Gruppe ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Primäre kortikale Astrozytenkulturen wurden aus 1–2 Tagen postnatalen SD-Ratten wie zuvor beschrieben hergestellt . Mit einer sterilen 20-μl-Pipettenspitze wurden Kratzer auf der Zellschicht gemacht. Anschließend wurden die Platten mit sterilem PBS gespült, um Zelltrümmer zu entfernen, und durch frisches Zellkulturmedium, ergänzt mit 1 % fötalem Rinderserum (FBS), ersetzt. Cimetidin, Rp-cAMP oder NSC23766 wurden in der angegebenen Konzentration dem Mediumersatz hinzugefügt, während Histamin 30 Minuten später hinzugefügt wurde. 0, 24 und 48 Stunden nach dem Kratzen wurden die Zellen mit GFAP angefärbt oder unter einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus, Japan) beobachtet. Der Abstand zwischen den beiden Rändern des Kratzers wurde durch Messung der Wundfläche dividiert durch die Länge des Kratzers mithilfe der NIH Image J-Software bestimmt. Für die Analyse kleiner GTPasen wurden Zellproteinproben 2 Stunden nach dem Scratchen vorbereitet.

Für die Immunhistochemie wurden die Ratten mit Choralhydrat (350 mg/kg) anästhesiert und transkardial mit eiskalter normaler Kochsalzlösung und 4 % Paraformaldehyd perfundiert. Die Gehirne wurden entnommen und 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C und dann 3 Tage lang in 30 % Saccharose in PBS nachfixiert. Gefrorene Gehirnschnitte wurden auf einem Kryostat (Leica, Deutschland) bei 10 μm geschnitten. Für die Immunzytochemie wurde die Monoschicht der Astrozyten 10 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die kultivierten Astrozyten oder die Gehirnschnitte wurden dann mit 3 % normalem Eselserum in PBS, das 0,1 % bzw. 0,3 % Triton X-100 enthielt, jeweils 15 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurde der Primärantikörper für GFAP (1:400, Boster, China) zur Inkubation über Nacht bei 4 °C aufgetragen. Nach wiederholtem Waschen in PBS wurde Alexa 488-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG (1:400; Invitrogen, USA) für eine 2-stündige Inkubation bei Raumtemperatur angewendet. Zur F-Actin-Färbung wurden die Zellen anstelle der Antikörper-Inkubation 30 Minuten lang in Rhodamin-Phalloidin (1:500, Invitrogen, USA) inkubiert. Nach wiederholtem Waschen wurden die Schnitte oder die kultivierten Astrozyten in Eindeckmedium mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1000; Sigma, USA) eingelegt. Abschließend wurden Bilder unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus BX51; Japan) aufgenommen. Zur Quantifizierung der Glia-Narbe wurde eine histochemische Diaminobenzidin-Färbung durchgeführt. Endogene Peroxidasen wurden durch Behandlung mit 3 % H2O2 in Methanol gelöscht und die Objektträger wurden mit 10 % normalem Ziegenserum blockiert. Anschließend wurden die Objektträger mit Antikörper für GFAP (1:200, Boster, China) gefärbt und mit dem Histostain-Plus IHC Kit (MR Biotech, China) verarbeitet. Anschließend wurden die Schnitte montiert, nachdem sie dreimal 10 Minuten lang mit PBS gewaschen worden waren. Die Messung der Glia-Narbenfläche, die Zellzählung und die Morphologieanalyse wurden mit Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, USA) und Image J-Software (NIH, Bethesda, MD) durchgeführt. Die Länge der Vorsprünge wurde als Abstand von der Rückseite des Zellkerns bis zur Spitze der Vorsprünge bestimmt. Die Breite wurde am unteren Ende der Vorsprünge bestimmt. Polarisierte Zellen wurden bewertet, wenn die Länge des Vorsprungs die Breite des Vorsprungs mindestens viermal überstieg45. Insgesamt wurden für jedes Tier etwa 500 Astrozyten aus dem Glia-Narbenbereich von 3 Schnitten untersucht.

Um die Infarktfläche zu quantifizieren, wurden auf einem Kryostaten (Leica, Deutschland) serielle koronale Hirnschnitte bei 30 μm geschnitten und alle 1,5 mm im gesamten Gehirn gesammelt. Die Schnitte wurden mit 1 % TB gefärbt, um Nicht-Infarktgewebe zu definieren. Der Prozentsatz der Infarktfläche wurde als 100-faches Verhältnis der Infarktfläche zur gesamten kontralateralen Hemisphärenfläche berechnet. Der von reaktiven Astrozyten umgebene Infarktbereich wurde auch nach der GFAP-Immunfärbung mit den gleichen Mitteln geschätzt.

Die kultivierten Astrozyten wurden in Proteinextraktionsreagenz homogenisiert. Das aktive GTP-gebundene Rac1 wurde mit dem GTPase Pull-Down Kit (Thermo, USA) isoliert. Proteinproben wurden dann auf 12,5 % SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und dann elektrotransferiert auf eine Nitrozellulosemembran. Nach dem Blockieren mit 5 % fettfreier Milch wurden die Membranen mit Primärantikörpern gegen rac 1 (1:500; Millipore, USA) und GAPDH (1:3.000; KangChen, China) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach wiederholtem Waschen wurden die Membranen mit IRDye 800 Anti-Kaninchen-Molekularsonde (1:8000, LI-COR Biosciences, USA) oder IRDye 700 Anti-Maus-Molekularsonde (1:3000, LI-COR Biosciences, USA) für 2 umgesetzt H. Die Bilder wurden mit dem Infrarot-Bildgebungssystem Odyssey (LI-COR Biosciences, USA) aufgenommen und analysiert.

Der Migrationstest wurde gemäß früheren Berichten mit der BD matrigelTM-Invasionskammer (24 Vertiefungen) durchgeführt46. Kurz gesagt wurden Astrozytensuspensionen (2 × 106/ml, 0,2 ml mit 1 % FBS) in die Transwell-Einsätze gegeben, während Histamin in der angegebenen Konzentration in die unteren Wells mit 5 % FBS geladen wurde. Nach 24-stündiger Inkubation wurde der Einsatz aus dem Transwell entfernt und nicht migrierende Zellen wurden durch vorsichtiges Wischen des Inneren des Transwells mit einem Wattestäbchen entfernt. Anschließend wurden die migrierten Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit Kristallviolett angefärbt. Zur quantitativen Analyse wurde die Anzahl der migrierten Zellen in jedem Einsatz gezählt.

Die Astrozyten wurden bei 3 × 105/ml in 10–7 mol/L Histamin für 30 Minuten auf Kulturplatten mit 96 Vertiefungen subkultiviert, die zuvor mit Poly-L-Lysin oder Laminin beschichtet wurden38. Nach wiederholtem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit MTT (Sigma, USA, 0,5 mg/ml als Endkonzentration) 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurde die überstehende Schicht entfernt und 100 μl Dimethylsulfoxid in jede Vertiefung gegeben. Der MTT-Metabolismus wurde spektrophotometrisch bei 570 nm mit einem Biotek-Mikroplattenlesegerät (USA) quantifiziert.

Alle Daten wurden blind gesammelt und analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die neurologischen Defizitwerte an jedem Testtag werden mit dem nichtparametrischen Kruskal-Wallis-H-Test analysiert. Andere Verhaltensdaten innerhalb jedes Testtages oder aus jedem Test und andere Mehrfachvergleiche in pathologischen Untersuchungen und In-vitro-Zellkulturexperimenten wurden durch eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von einem Tukey-Test analysiert, während für andere Vergleiche zwischen zwei Schwanz-Student-T-Tests angewendet wurden zwei Gruppen. Darüber hinaus wurde ein allgemeines lineares Modell verwendet, um den Latenzunterschied zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen im Morris-Wasserlabyrinthtest unter Berücksichtigung aller Testtage zu analysieren. Bei allen Analysen waren die Tests zweiseitig und ein P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Die Berechnung der Stichprobengröße basiert auf der Formel: ; μα = 1,62 (α = 0,05); μβ = 1,28 (β = 0,10); σ = die durchschnittliche SD; δ = der durchschnittliche Unterschied zwischen den Gruppen.

Zitierweise für diesen Artikel: Liao, R.-J. et al. Histidin bietet langfristigen Neuroprotektion nach zerebraler Ischämie, indem es die Migration von Astrozyten fördert. Wissenschaft. Rep. 5, 15356; doi: 10.1038/srep15356 (2015).

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81030061, 81273490, 81273506, 81473186), dem National Basic Research of China 973 Program (2011CB504403), der Zhejiang Province Natural Science Foundation (LY12H31006) und dem Program for Zhejiang Leading Team finanziert von S&T Innovation (2011R50014). Wir sind Muteflame Inc. (Windsor, Kanada) für die sprachliche Bearbeitung sehr dankbar.

Liao Ru-jia, Jiang Lei und Wang Rong-rong haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Pharmakologie, Schlüssellabor für medizinische Neurobiologie des chinesischen Gesundheitsministeriums, School of Basic Medical Sciences, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310058, China

Ru-jia Liao, Lei Jiang, Rong-rong Wang, Ying Chen, Ya Li, Lu Wang, Yu-dong Zhou, Xiang-nan Zhang, Zhong Chen und Wei-wei Hu

Abteilung für Pharmakologie, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310003, China

Rong-rong Wang, Xiang-nan Zhang, Zhong Chen und Wei-wei Hu

Abteilung für Pharmakologie, Kinderkrankenhaus der Zhejiang-Universität, Hangzhou, 310006, China

Hua-wei Zhao

Abteilung für Radiologie, zweites angegliedertes Krankenhaus, Medizinische Fakultät, Zhejiang-Universität, Hangzhou, 310009, China

Li-Yong Jie

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WWH und ZC stellten die Hypothese vor, entwarfen die Experimente und verfassten das Manuskript; RJL, LJ, RRW, HWZ und LYJ führten die Experimente durch; RJL, YC, YL, LW und XNZ analysierten die Daten; YDZ hat das Manuskript maßgeblich bearbeitet.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 30. November 2014

Angenommen: 09. September 2015

Veröffentlicht: 20. Oktober 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15356

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